nūhou

ʻO ka IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) kahi mea hoʻohālikelike o ka substrate β-galactosidase, kahi mea hiki ke hoʻokō.Ma lalo o ka induction o IPTG, hiki i ka inducer ke hana i kahi paʻakikī me ka protein repressor, No laila ke hoʻololi ʻia ka conformation o ka protein repressor, i hiki ʻole ke hui pū ʻia me ka gene target, a ua hōʻike maikaʻi ʻia ka gene target.No laila pehea e hoʻoholo ʻia ai ka ʻike o ka IPTG i ka wā o ka hoʻokolohua?ʻOi aku ka maikaʻi o ka nui?
ʻO ka mua, e hoʻomaopopo kākou i ke kumu o ka hoʻokomo ʻana o IPTG: ʻO ka operon lactose o E. coli (element) ʻekolu mau genes, Z, Y, a me A, e hoʻopili ana i ka β-galactosidase, permease, a me ka acetyltransferase.lacZ hydrolyzes lactose i ka glucose a me ka galactose, ai'ole i loko o ka allo-lactose;Hiki i ka lacY ke hele i ka lactose i loko o ke kaiapuni e hele i loko o ka membrane cell a komo i ka cell;Hoʻololi ka lacA i ka pūʻulu acetyl mai acetyl-CoA i β-galactoside, kahi e hoʻoneʻe ai i ka hopena Toxic.Eia kekahi, aia kahi kaʻina hana O, kahi kaʻina hoʻomaka P a me ka gene regulatory I. ʻO ka I gene code he protein repressor e hiki ke hoʻopaʻa i ke kūlana O o ke kaʻina hana, i hoʻopaʻa ʻia ka operon (meta). ua pio.Aia kekahi kahua hoʻopaʻa no ka paena hoʻopaʻa ʻana i ka protein-CAP ma luna o ke kaʻina hoʻomaka P. ʻO ka P sequence, O sequence a me CAP hoʻopaʻa ʻia i ka ʻāina hoʻoponopono o ka lac operon.Hoʻoponopono ʻia nā genes coding o nā enzymes ʻekolu e ka ʻāina hoʻoponopono like e hoʻokō ai i ka hōʻike hoʻonohonoho ʻana o nā huahana gene.

I ka loaʻa ʻole o ka lactose, aia ka lac operon (meta) i ke ʻano o ka paʻa.I kēia manawa, ʻo ka lac repressor i hōʻike ʻia e ka I sequence ma lalo o ka mana o ka PI promoter sequence e hoʻopaʻa i ke kaʻina O, ka mea e pale ai i ka RNA polymerase mai ka hoʻopaʻa ʻana i ke kaʻina P a kāohi i ka hoʻomaka transcription;ke loaʻa ka lactose, hiki ke hoʻoulu ʻia ka lac operon (meta) Ma kēia ʻōnaehana operon (meta), ʻaʻole ʻo ka lactose ponoʻī ka mea hoʻoulu maoli.Komo ka lactose i loko o ke keena a hoʻopaʻa ʻia e β-galactosidase e hoʻohuli ʻia i allolactose.ʻO ka mea hope, ma ke ʻano he molekele inducer, hoʻopaʻa i ka protein repressor a hoʻololi i ka conformation protein, kahi e alakaʻi ai i ka dissociation o ka protein repressor mai ke kaʻina O a me ka transcription.ʻO Isopropylthiogalactoside (IPTG) ka hopena like me ka allolactose.He mea hoʻoulu ikaika loa ia, ʻaʻole i hoʻoheheʻe ʻia e ka bacteria a paʻa loa, no laila ua hoʻohana nui ʻia i loko o nā laboratories.

Pehea e hoʻoholo ai i ka manaʻo kūpono o IPTG?E lawe iā E. coli i laʻana.
ʻO ka E. coli BL21 genetically engineered strain i loaʻa ka pGEX recombinant maikaʻi (CGRP/msCT) i loko o ka wai wai LB me 50μg·mL-1 Amp, a hoʻoulu ʻia i ka pō ma 37 ° C.Ua inoculated ka moʻomeheu luna i loko o 10 omole o 50mL hou LB wai medium i loaʻa 50μg · mL-1 Amp ma ka lākiō o 1:100 no ka hoʻonui moʻomeheu, a i ka OD600 waiwai he 0.6 ~ 0.8, IPTG i hoʻohui 'ia i ka hopena.He 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Ma hope o ka hoʻokomoʻana i ka mahana like a me ka manawa like, ua laweʻia ka 1 mL o ka hopena bacteria mai ia mea, a ua hōʻiliʻiliʻia nā pūnaewele bacteria e ka centrifugation a hoʻokomoʻia i SDS-PAGE e nānā i ka mana o nā manaʻo likeʻole IPTG ma ka'ōlelo protein, a laila koho i ka manaʻo IPTG me ka hōʻike protein nui loa.
Ma hope o nā hoʻokolohua, e ʻike ʻia ʻaʻole ʻoi aku ka nui o ka nui o ka IPTG.ʻO kēia ke kumu no ka loaʻa ʻana o ka IPTG i kahi mea make i ka bacteria.ʻO ka hoʻonui ʻana i ka manaʻo e pepehi pū i ke kelepona;a ma ka ʻōlelo maʻamau, ke manaʻolana nei mākou ʻoi aku ka nui o ka soluble protein i hōʻike ʻia i loko o ke kelepona, ʻoi aku ka maikaʻi, akā i nā manawa he nui ke kiʻekiʻe o ka manaʻo o ka IPTG, e hoʻokumu ʻia ka nui o ka hoʻopili.Ke kino, akā ua emi ka nui o ka protein soluble.No laila, ʻo ka manaʻo IPTG kūpono loa ʻaʻole i ʻoi aku ka maikaʻi o ka maikaʻi, akā ʻo ka haʻahaʻa haʻahaʻa.
ʻO ke kumu o ka hoʻokomo ʻana a me ka hoʻoulu ʻana i nā kānana genetically engineered e hoʻonui i ka hua o ka protein target a hoʻemi i nā kumukūʻai.ʻAʻole pili wale ka hōʻike ʻana o ka gene target e nā kumu ponoʻī o ka strain a me ka ʻōlelo plasmid, akā me nā kūlana ʻē aʻe o waho, e like me ke ʻano o ka inducer, ka wela induction a me ka manawa induction.No laila, ma ka laulā, ma mua o ka hōʻike ʻana a hoʻomaʻemaʻe ʻia kahi protein ʻike ʻole, ʻoi aku ka maikaʻi o ke aʻo ʻana i ka manawa induction, ka mahana a me ka ʻike IPTG i mea e koho ai i nā kūlana kūpono a loaʻa i nā hopena hoʻokolohua maikaʻi loa.